Zasada działania pipety Pasteura opiera się głównie na przepływie-grawitacyjnym i działaniu kapilarnym w połączeniu z ręczną kontrolą różnic ciśnień powietrza w celu ułatwienia aspiracji i przenoszenia cieczy.
Ręczna kontrola ssania: operator zasysa szeroki koniec pipety-doustnie lub za pomocą dodatkowej gumowej gruszki-, aby wytworzyć podciśnienie w rurce, wciągając w ten sposób ciecz do cienkiej końcówki.
Dozowanie-grawitacyjne: po zwolnieniu ssania ciecz wypływa w naturalny sposób pod wpływem grawitacji; dozowanie można również ułatwić, delikatnie ściskając korpus pipety lub przechylając naczynie odbierające.
Odtwarzalność kropel: Kalibrując stosunek „kropli na mililitr”, pipeta umożliwia przybliżony transfer ilościowy, dzięki czemu nadaje się do procedur wymagających raczej powtarzalności niż absolutnej precyzji.
Zapewnienie sterylności: przed użyciem można włożyć bawełniany korek do szerszego końca i wysterylizować, aby zapobiec zanieczyszczeniu mikrobiologicznemu podczas obsługi-, co jest praktyką szczególnie powszechną w eksperymentach mikrobiologicznych.